产品及特点

草莓角斑病是草莓生产上危害严重的细菌性病害 ,其病原菌是草莓角斑病菌(Xanthomonas fragariae),属于薄壁菌门(Gracilicutes)假单胞菌科(Pseudomonaceae)黄单胞菌属。草莓角斑病是草莓生产上危害极其严重的细菌病害。因此本试剂盒专门针对检测草莓黄单胞菌开发的 PCR试剂盒，具有以下特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、引物根据草莓黄单胞菌设计，特异性高。

3、荧光定量 PCR检测，比常规 PCR更加灵敏，可达到 60拷贝/反应。

4、一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本产品只适用于科研。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

DNA模板、超纯水、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁶拷贝/μL这 5个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。

1、标记 5个离心管，分别为 6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 6号管中加入 5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 5号管中加入 5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 4号管中加入 5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 5个稀释度的标准曲线样品，放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是样品制备 PC(样品制备阳性对照)，一个是样品制备 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。

8、用自选方法纯化 N+2个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，5个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用试剂盒提供的阳性对照的 10000倍稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 cDNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 36。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 33。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 36则为阴性，如果小于或等于 33则为阳性。如果在 33-36之间，可结合熔解曲线判断，若样品的熔解温度与阳性对照相同，该样本判断为阳性，否则为阴性。结果如下图所示：