产品及特点

莱氏无胆甾原体属于柔膜体纲，支原体目，无胆甾原体科，无胆甾原体属。

莱氏无胆甾原体最初分离自污水、肥料、腐土质、土壤和植物组织，后来人们发现在牛生殖道和鼻腔、猪鼻腔、人口腔、鸡窦等各种哺乳动物和鸟类中均发现其寄生现象。莱氏无胆甾原体也是常见的污染细胞的支原体之一。荧光定量 PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测莱氏无胆甾原体的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据莱氏无胆甾原体高度保守区设计，不会跟其他病原DNA发生交叉反应。

5、本产品足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

6、本产品只能用于科研。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。

1、注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

2、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入 45  μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

4、在 7号管中加入 5  μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 6号管中加入 5  μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、换枪头，在 5号管中加入 5  μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

9、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

10、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

13、具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在  530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

15、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。