产品介绍 产品及特点 放线菌(Actinomyces spp.)在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存 在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌是一类极其重要的微生物资源。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约 70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等)、维生素(B12)和有机酸等。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义，检测放线菌具有重要的意义。荧光定量 PCR是检测微生物的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR技术为基 础开发的专门检测放线菌的试剂盒，它具有下列特点： 1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。 2、特异性高，引物是根据人放线菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。 3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR高 100倍。 4、提供无传染性的 PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。 5、一管式操作，荧光 PCR检测，不容易产生环境污染。 6、本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50次 20μL体系的 PCR。 规格及成分
运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。 自备试剂 样品 DNA。 使用方法 一、制备标准曲线样品(以 102-107拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 DNA片段作为阳性对照。 1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。 2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。 3、在 7号管中加入 5 μL阳性对照(其浓度为 1×108拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 二、样品 DNA的制备 7、用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。 8、如果有 N个样品，则需要进行 N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 20次免 DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为 PCR模板。 三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行) 9、如果进行定量分析，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6个标准曲线样品只选一个做(可以选 4号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。 10、在标记管中按下表加入各成分：
注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。 11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。 四、荧光定量 PCR反应参数
五、数据处理 12、设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。 13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。 14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 25。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 20。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 25则为阴性，如果小于或等于 20则为阳性。如果在 20-25之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 25则为阴性，如果小于 25，则为阳性。 |
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