1、RT-PCR、qPCR、Real-time PCR、real-time RT-PCR有什么区别？

RT-PCR就是逆转录 PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。

Real-time-PCR和 qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR )是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。

虽然Real-time PCR(实时荧光定量PCR)和 Reverse transcription PCR(反转录PCR)看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR(quantitative real-time PCR)。

而real-time RT-PCR(RT-qPCR)，就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从 RNA反转录得到 cDNA(RT)，然后再用 Real-time PCR进行定量分析(qPCR)。

2、为什么荧光定量PCR的扩增产物片段长度应该控制在80-300bp范围内？

每个基因序列长短不一，有的好几kb，有的几百bp，但是我们在设计引物的时候只需要要求产物长度80-300bp，太短或者太长都不适合做荧光定量PCR检测。

产物片段太短，无法跟引物二聚体区分，引物二聚体的长度大概在30-40bp，小于80bp很难区分是引物二聚体还是产物。产物片段太长，超过300bp，容易致使扩增效率低下，不能有效的检测出该基因的量。

打个比方，你在数一间教室里面有多少个人的时候，只需要数一下有几张嘴就可以了，在检测基因的时候也是一样的，只需要检测某个基因的某一段序列来代表整个序列即可。如果你为了想数多少个人，既要数多少张嘴也要数多少个鼻子、耳朵、眼镜，反而容易数错。

3、PCR技术中加入的“引物”是什么？有什么作用？引物会在PCR仪中复制吗？

引物是在DNA分子复制时起引导作用一段短RNA或单链DNA片段，可结合在脱氧核苷酸链上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。细胞内的引物是RNA链，由RNA酶根据DNA链碱基序列自动合成。

在PCR技术中，引物是人工合成的两段寡核苷酸链序列，是单链DNA片段。由于DNA聚合酶的特异性和DNA分子两条链的两端的差异性，决定了DNA分子体外扩增时必需设计两种引物，分别与DNA分子两条模板链的两端的感兴趣区域互补，以利于DNA聚合酶由此定向向前延伸，起到很好的引导作用。

对于一段需扩增的DNA的核苷酸序列，引物可根据这一序列经计算机设计并合成，使其能有效地扩增模板DNA序列，引物设计的优劣直接关系到PCR技术扩增DNA的成功与否。引物不会在PCR仪中复制，引物是设计并配比好后加入PCR仪溶液中的。体外人工设计的引物广泛用于DNA聚合酶链反应(PCR技术)、测序和探针合成等。

4、引物设计最佳长度是多少？

一般来说，引物长度大概在20-24bp范围是比较好的。当然我们在设计引物的时候一定要注意引物的TM值，因为这个关系到最佳退火温度。经过大量的实验证明，60℃是一个比较好的TM值。退火温度太低容易导致非特异性扩增，退火温度太高一般会导致扩增效率比较低，扩增曲线起峰比较晚，CT值延后。

5、采集样本量的多少会不会影响实验结果？

不会。很明显，采集样本量多，提取的RNA就比较多，cDNA就比较多，目的片段就比较多。对于绝对定量，要计算出某个目的片段的拷贝数，那么采集样本量的多少肯定会影响实验结果。比如检测血液里面的乙肝病毒HBV，就是检测出一定量(1ml)血液里面的HBV含量。

对于科研工作中常用的相对定量，样本量的多少与实验结果无关，因为相对定量是指目的基因和内参基因相比较，你可以认为它们是存在于同一核酸链条的上下游片段，如果样本量多了，内参基因和目的基因都同时等比例增加，不影响结果。

6、反转录酶效率高低会不会影响实验结果？

同上。此处必须注意，我们希望获得较高的反转录效率，更希望反转录酶的反转录效率比较稳定，得到均一性的结果。这就要考验各大公司对于反转录试剂盒的优化能力了。

7、在PCR技术操作中，是否需要能量，需向溶液中加ATP吗？

DNA分子在PCR仪中扩增与在细胞内复制相似，也需要原料、能量、酶、引物、适宜的温度和pH等，但PCR技术操作中不需要单独提供ATP作为供能物质。

在PCR技术中，DNA复制的解旋断裂氢键的能量来自PCR仪的加热，高温达90℃～95℃时DNA分子双链即打开，dNTP的连接能量来源于Taq酶聚合基本单位dNTP加入到延伸链的3'端与上一个核苷酸形成磷酸二酯键时释放一个焦磷酸PPi，焦磷酸不稳定极易水解，释放能量并产生磷酸，这两个反应互相偶联，推动Taq酶聚合单体延伸DNA分子。

8、Taq酶的效率会不会影响实验结果？

Taq酶的效率影响比较大，一般要求用热启动Taq酶，且效率要比较高才行，商品化的荧光定量试剂盒，每个厂家都会在自己的产品的基础上，把效率优化到最好的状态，接近于100%，效率太低实验结果不可用。对于不同公司的产品，这是衡量优劣的指标。

9、荧光染料的多少会不会影响实验结果？

当然是有影响的。荧光染料过于饱和，会导致某些仪器出现噪点干扰；荧光染料不饱和，荧光值太低，导致提前进入平台期，扩增曲线平缓。在荧光定量实验中主要看CT值，因此后期扩增曲线进入平台期显得不那么重要，只是图形不够美观罢了，如果二者必选其一的话，宁愿选择荧光染料略微不饱和。在使用同一公司的同一款产品时，该影响基本可以忽略。

10、PCR管的透光度会不会影响实验结果？

当然是有影响的。但是对于同一厂家同一批耗材，这种影响可以忽略。推荐大家用96孔板加高透膜，使耗材的透光度影响降到最低。

11、操作过程中的误差会不会影响？

操作过程的影响，主要体现在均一性上。均一性是指体系内的所有组分均匀的混合在一起，瞬时离心可以解决均一性问题。另外，对于生手来说，最好调整PCR体系在20ul以上，过小的体系更容易产生误差。再请看下图：如果退火温度优化得合适，引物浓度对CT的影响会降到最低。你会明白，有的操作误差(比如引物浓度)是可以通过优化退火温度来避免的。

12、没有Ct值

检测结果遇到没有Ct值情况，排查是否有以下问题

①循环数不够(一般不超过45循环，不仅背景值提高，定量也不准)；

②PCR程序设置错误，检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中；

③引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解；

④模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng，根据试剂盒说明书即可)，对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起；如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融；

⑤引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

13、Ct值过晚

在相对定量中， Ct值一般控制在15—25之间比较好，如果在绝对定量中，对低拷贝数的样品，Ct值会增大，但是一般不宜超过40循环，否则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要根据具体实验设计和目的进行。

①扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适，需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；

②PCR程序不合适，改用三步法进行反应，或者优化退火/延伸温度，可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s)；

③MgCl₂浓度不合适，增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；

④PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp；

⑤模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

14、阴性对照扩增有信号

照扩增有信号排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：

①引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

②引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

③镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。

④模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。

⑤交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染，或操作环境中有气溶胶造成污染，建议对操作环境进行处理，或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。

15、标准曲线不佳

标准曲线线性关系不佳(R²<0.9)，很有可能是以下环节存在问题:

①标准品稀释或者加样误差，使得标准品不呈梯度；

②标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装，保存于-20℃或-80℃，现配现用；

③引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针；

④模板中存在抑制物。模板浓度过高，根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以50～500ng为宜。