产品及特点

田鼠痘病毒(Volepox Virus)会引起鼠痘，该病多呈爆发性流行，致死率较高，常造成小鼠全群淘汰，危害极大。临床表现以四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征。本病毒的自然宿主为小鼠，不同品系小鼠的易感性差异很大。本病常感染野生小鼠，使野生小鼠成为另一种危险的传染源，因此田鼠痘病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的田鼠痘病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2、根据田鼠痘病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3、灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4、一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。

5、本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。

6、本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释PCR阳性对照(以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)

1、注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)。

4、在7号管中加入5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8、如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10⁵拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9、用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。

三、设置qPCR反应(20 μL体系，在样品制备室进行)

10、如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

13、数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471 nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500 nm，最大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

15、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。