产品及特点

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)在分类上属细小病毒属细小病毒科，是一种单链 DNA病毒。CPV是感染犬、猫、狼、狐等动物并引起细小病毒病，感染率高达100%，致死率 10-50%。PCR是目前检测 CPV最灵敏的方法，本产品就是定性 PCR产品(产品编号 11-150)基础上升级的定量 PCR检测试剂盒，专门用于定量鉴定检测 CPV。本试剂盒具有下列特点：

1、根据 CPV衣壳蛋白基因 VP2设计的针对 CPV的 PCR引物，专一性强。

2、即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

3、一管式荧光定量 PCR检测，避免后续污染。

4、本试剂盒足够 100次 20uL反应体系的荧光定量 PCR。

5、本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

运输及保存

低温运输、-20℃保存(A袋和 B袋的试剂放样品准备区、C袋的阳性对照**跟 A袋和 B袋的成分分开放置)，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、样品 DNA的制备

1、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的柱式病毒 DNAout。

二、引物的制备(在样品制备室进行)

2、按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水(加入量见引物试管上的标签)，使得两条引物的浓度均为 10 μM(10pmol/μL)，然后各取 110 μL混合在一起，标注为引物混合物，放冰上待用。此引物混合物足够 100次 PCR。三、稀释阳性对照(以 10²-10⁷这 6个 10倍稀释度为例。由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 180bp的 DNA片段作为阳性对照。

3、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

4、用带芯枪头分别加入 45 μL超纯水(**用带芯枪头，下同)。

5、在 7号管中加入 5 μL本试剂盒提供的 10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得 10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、换枪头，从 6号管中取 5 μL溶液到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

8、换枪头，从 5号管中取 5 μL溶液到 4号管中，得 10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

三、设置 PCR反应(20 μL体系，在样品制备室进行)

9、在 PCR管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX。

10、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(可以根据仪器不同而自行优化)。

11、数据采集

在每个循环的**步进行荧光信号的采集，具体操作按所用仪器推荐的流程进行。

本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。

四、数据处理

12、以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品浓度的 log和标准曲线计算出样品 DNA的浓度。