产品及特点

克柔念珠菌(Candida krusei)作为临床五大常见念珠菌之一，其感染多见于患有血液系统肿瘤等免疫力低下的患者,可引起粘膜感染、真菌血症以及其它实质器官的感染。临床上应用氟康唑预防真菌感染、近年来器官移植的开展以及广谱抗生素等的使用，均使得克柔念珠菌的发病率逐年上升，引起的死亡率居高不下。本公司开发克柔念珠菌染料法荧光定量 PCR试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、引物根据克柔念珠菌专一区设计，特异性高。

3、荧光定量 PCR检测，比常规 PCR更加灵敏。

4、一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、超纯水、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释 PCR阳性对照(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)

1、注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA片段作为阳性对照。

2、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)。

4、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头，在 6号管中加入 5 μL  1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL  PCR阳性对照的10000倍稀释的(稀释后浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 10万拷贝，可以将 10μL原液加入到 990μL自备 TE溶液中，充分混匀，此为 100倍稀释液。再取 10μL此稀释液加入到 990μL自备 TE溶液中，充分混匀，此为 10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。

9、用自选方法纯化 N+2个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR反应(20  μL体系，在样品制备室进行)

10、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液，浓度为 10⁴拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

四、数据处理

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 cDNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 35则为阴性，如果小于或等于 30则为阳性。如果在 30-35之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于35，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。