产品及特点

拟杆菌属(Bacteroides)是指革兰氏染色阴性、无芽孢、专性厌氧的小杆菌。又称类杆菌属。正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道。本产品就是以染料法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测拟杆菌属的通用试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物等组分经过优化，灵敏度高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据拟杆菌属 DNA高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA发生交叉反应。

5、既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。

6、本产品足够 50次 20μL体系的染料法荧光定量 PCR反应。

7、本产品只能用于科研。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10⁶拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入 45  μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同。

3、在 6号管中加入 5  μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 5号管中加入 5  μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 4号管中加入 5  μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品待提取，**设置 N+2个提取，多出的是 PC(样品制备阳性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 10000倍稀释液 10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。三、SYBR qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:个别 qPCR仪器型号需要添加 ROX染料校正，以消除管之间的光程差使其保持一致以使实验达到更准确的数据。该试剂盒成分已包含 ROX染料 II，需 ROX染料 II的机型不需要额外添加。

需使用 ROX染料 I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus，建议终浓度 500nM。

需使用 ROX染料 II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ  Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000，建议终浓度 50nM。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于 30。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于 29。对待测样品，如果其 Ct≥30则为阴性，如果≤29则为阳性。如果在 29-30之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果≥30则为阴性，如果小于 30，则为阳性。熔解曲线也须一并考虑，如果熔解 Tm值与目的扩增片段 Tm特征值相差≥2℃，则为非特异性扩增，不是真正的阳性扩增。